细胞培养基 Dulbecco 改良的Eagle 培养基（Dulbecco modified Eaglemedium，DMEM）、血清、碳酸氢钠和青链霉素购自美国 Invitrogen 公司；dNTP 和 Taq 酶购自日本 TaKaRa 公司；Hank 液购自美国 Hyclone 公司。PTC-200PCR 仪为美国Bio-Rad 公司产品；miniMAG 自动核酸提取仪为法国生物梅里埃公司产品；NU-4750E 细胞培养箱、NU-425-400E IIA2型生物安全柜为美国 Nuaire 公司产品；ECLIPSE80i 荧光显微镜为日本 Nikon 公司产品；二级安德森微生物气溶胶采样器由辽阳市应用技术研究所提供；DV40 型全玻璃直角气溶胶发生器由北京比赛福生物安全技术有限公司提供。 气溶胶主动发生的模拟 在生物安全柜正常运转情况下，在柜内将 10 ml rAdvGFP 病毒液置于 DV40 全玻璃直角气溶胶发生器内。发生器和安德森采样器的摆放位置如图 1A，发生器管口距离安全柜台面约 12 cm。分别在距离发生器管口 0、10 和 20 cm 处的安全柜台面上放置采样器和培养皿，用于病毒气溶胶和沉降病毒颗粒的采集。采样器分上下两层，其采样撞击孔孔径分别为 0.5 和0.2 μm，内置培养皿，在每组采样器的内侧平行位置放置 3 个培养皿，每个培养皿内放置 5 ml 采集液，在气溶胶发生 30 s 后，计时连续采集 5 min，收集各采样器及培养皿中的液体进行检测。1.2.2 吹打及振荡模拟试验 将 10 ml 病毒液置于 50 ml 离心管中，离心管距离安全柜操作台面约12 cm。在模拟吹打的操作中，用微量移液器反复吸取吹打病毒液，期间避免病毒液溢洒和喷溅；在模拟振荡操作中，将 10 ml 病毒液置于 50 ml 离心管中，用振荡器的最大速度涡旋振荡病毒液1 min 后立即打开管盖采集 2 min，然后盖紧再次震荡 30 s 后开盖继续采集，模拟振荡的操作见图 2A。两组模拟操作中，均在距离离心管管口0 和 10 cm处的安全柜台面上放置采样器，在采样器的内侧平行位置放置培养皿进行病毒的采集，均采集 5 min 后收集各采样器及培养皿中的采集液进行检测。1.2.3 病毒浓缩 将采样器和培养皿中的采集液收集到 15 ml 离心管中，加入终浓度为 400 μg/μl的阳离子多聚物聚凝胺（polybrene，PB），置 37 ℃孵育 30 min，于室温 2300 × g 离心 40 min 后弃上清，悬于 800 μl 不含血清的 DMEM 孵育液，得到浓缩后样本。取浓缩后的样本 200 μl 接种至24 孔板上培养单层的人胚肾 293 细胞（8 × 104 细胞/孔），每个样本接种 2 孔，700 × g 室温低速离心 45 min，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育 1 h后弃去孵育液，更换含 2% 胎牛血清的 DMEM培养液继续培养 48 h 后，在荧光显微镜下观察GFP 荧光。对未见明显 GFP 荧光出现的样本连续培养 3 代，培养 3 代后仍未见 GFP 荧光的则认为病毒未复制。所有试验均重复 3 次。1 . 2 . 4 PCR 检测 取 200 μ l 浓缩样本用miniMAG 自动核酸提取仪提取病毒核酸，用腺病毒特异性引物进行 PCR 检测。腺病毒检测引物序列分别是上游 AdVF：5’ GCCSCARTGGKCWTACATGCACATC 3’；下游 AdVR：5’ CAGCACSCCICGRATGTCAAA 3’[7]。PCR 反应体系，10 × 缓冲液2 μl、10 mmol/L 的 dNTP 0.4 μl、50 μmol/L 上、下游引物各 0.3 μl、5 U/μl 的 Taq DNA 聚合酶0.2 μl、灭菌双蒸水 14.8 μl、核酸 2 μl，总体积为20 μl。PCR 反应程序为：94 ℃ 预变性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。反应结束后取 5 μl 扩增产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳分析，扩增目的片段大小为301 bp。为了评价安德森采样器的采样效率以建立方便的病毒气溶胶采集体系，首先用气溶胶发生器模拟病毒气溶胶的主动发生，将采样器和采集沉降病毒的平行放置培养皿中的采集液经 PB 浓缩后，进行核酸检测和接种 293 细胞，观察病毒的复制。在距离发生器管口 0 和 10 cm 处放置的各培养皿和采样器以及在距发生器管口 20 cm 处放置的培养皿和采样器 2 中均检测到病毒核酸，但置于20 cm 处的采样器 1 未检测到病毒核酸。用上述样本接种 293 细胞，在培养 48 h 后均可在荧光显微镜下观察到细胞中的绿色荧光。这些结果表明，在距离发生器管口 0、10 和 20 cm 处放置的不同孔径的采样器中均可采集到病毒气溶胶（图 1B、1C）。