在自然界空气中含有大量的生物性气溶胶, 其中生物因子主要包括细菌、真菌、病毒、细菌和真菌毒素、多肽、花粉、植物纤维、高分子量变态反应原等。空气中生物因子通过与人皮肤接触、呼吸道吸入、消化道摄入等途径进入人体〔1〕, 可以引起接触性传染病、呼吸道疾病、急性中毒、过敏性反应等严重危害〔2〕。近年来, 人们已经意识到生物气溶胶暴露对人类健康造成的重大影响, 陆续展开了对生气溶胶监控及多方面特性的研究。要研究生物气溶胶, 就必须先对其采样, 获得研究样本。自从空气微生物采样器问世以来, 至今已经研制和开发出数百种采样器, 广泛地用于各个领域。但到目前为止, 还没有一种采样器能保证采到的空气微生物标本完全反映原始状态, 根据不同原理制造的采样器都具有局限性, 因此对各采样器进行采样效率评价具有重要意义。目前, 有许多关于空气微生物气溶胶采样器采样效率的比较研究报道, 但其研究方法主要基于自然条件下的若干采样器同时采样〔3 ～ 5〕。自然条件下中国消毒学杂志 2009年第 26卷第 3期 · 245·比较采样器的采样效率受许多外源因素的影响, 比如所采集微生物的存活力、气溶胶粒子的粒径分布情况以及不断变化的周边大气环境等。为更科学地评价不同微生物气溶胶采样器的效率, 选择出采样效率接近自然状态的采样器, 我们采用微生物气溶胶发生法于气雾柜内进行空气微生物采样器采样效率的比较, 可以人为控制气溶胶发生条件, 从而得以排除自然大气环境下的众多可变因素, 建立可控性强的实验室微生物气溶胶发生系统, 使空气微生物采样器的采样效率得以恰当评价。1　材料与方法1.1　实验材料试验以六级安德森空气微生物采样器为基准,对二级安德森撞击式空气微生物采样器、LWC-1型离心式空气微生物采样器、AGI-30 全玻璃液体冲击式采样器, 均由辽阳应用技术研究所生产;MerckMAS-100 单级撞击式采样器, 由德国Merck公司生产;过滤式空气微生采样器, 所用滤膜为孔径0.2 μm、直径60 mm的混合纤维滤膜, 购自北京升河膜诚信科技发展中心。气溶胶发生系统由TK型气溶胶发生器、流量计及空气传送、过滤相关器材组成。气溶胶发生验技术平台为气雾柜和气雾室。气雾柜位于气雾室内(长132 cm, 宽76 cm, 高170 cm), 为封闭的柜体, 连接高效过滤系统, 气溶胶发生于柜中进行。20m3的气雾室内设有监控系统, 包含压力自控系统、独立送排风系统及高效过滤系统指示微生物为粘质沙雷菌(ATCC8039)株, 军事医学科学院微生物流行病研究所菌种保藏库提供。1.2　实验方法1.2.1　菌悬液制备　取粘质沙雷菌种经平板划线接种分离培养, 取典型菌落接种增菌肉汤于37℃荡培养24 h, 用磷酸盐缓冲生理盐水将新鲜培养物稀释至含菌量为103 cfu/ml的菌悬液。1.2.2　发生气溶胶　将气溶胶发生系统的各个组件依次连接, 开启气雾室监控系统, 设置工作状态为排风、室压为-15Pa。将TK型气溶胶发生器固于气雾柜内, 高度1.2 m。将装有30ml菌悬液专用瓶与气溶胶发生器连接。将两个待测采样器对称放置, 使二者与发生器的距离和角度保持一致, 并用软管将采样器与柜外的抽气泵相连接。保持气雾柜环境温度20℃ ～ 22℃, 相对湿度20% ～ 24%, 关闭柜门。启动气溶胶发生器, 以10 L/min的气体流量发生微生物气溶胶, 待气雾柜中气溶胶发生3 min后,开动采样器进行采样。1.2.3　分组采样　按照被考核的5种采样器设计5组采样, 六级安德森采样器(基准参照采样器)与每种待测采样器搭成一组, 因此每组两个采样器同时采样。各采样器采样流量与采样时间参数见1, 采样结束后气雾柜排气10 min。每组重复3次。表1　各采样器采样流量与采样时间采样器型号采样流量(L/min)采样时间(min)六级安德森采样器28.3 1二级安德森采样器28.3 1MerckMAS-100 采样器100.0 1AGI-30液体采样10.0 3LWC-1 采样器40.0 1过滤式采样器28.3 1.2.4　培养与计数　两种安德森采样器、LWC-1、MerckMAS-100采样器每次采样后取出采样平板可直接置于温箱培养, 过滤式采样器将滤膜取下贴于营养琼脂培养基表面, AGI-30液体冲击采样器内采样液经滤膜过滤再将滤膜贴于营养琼脂培养基表面, 一并置于37℃孵箱内培养48h, 计数平板上菌落数, 计算采样结果按照以下公式计算气溶胶细菌含量:黏质沙雷菌气溶胶含菌量(cfu/m3 )=菌落总数×1000/(采样器流量×采样时间)1.2.5　气溶胶颗粒中值直径计算根据六级安德森每级平板所采集的粒子数计算出生物气溶胶颗粒的中值直径。计算方法是以六级采样器第1级至第6级所捕获粒子粒径大小依次为>7 μm、4.7 ～ 7.0μm、3.3 ～ 4.7 μm、2.1 ～ 3.3 μm、1.1 ～ 2.2 μm、0.65 ～ 1.10 μm, 将各级平板采集的气溶胶颗粒按级别分为6组数据, 依据偏态分布50%中值直径计算公式算出发生生物气溶胶总粒子的中值直径。偏态分布50%中值直径计算公式如下:粒子中值直径P50 =L+(i/f)(50%n-C)(公式中L为累积频数中值的组距下限, i为累积频数中值的组距, f为累积频数中值的粒子数, 50%n为累积频数中值所在组的累积频数, C为累积频数中值)。2　结果2.1　粘质沙雷菌气溶胶粒子粒径分布从六级安德森采样器5组采样结果中每组随机抽取1次采样结果, 共5个采样样本进行气溶胶粒子粒径分布分析, 粘质沙雷菌气溶胶颗粒在六级安德森采样器每级的粒子数以及累积频数见表2, 计算得到5次发生粘质沙雷菌气溶胶颗粒的中值直径· 246· ChineseJournalofDisinfection　2009;26(3)为1.60 ±0.08 μm。2.2　不同采样器采样气溶胶细菌含量结果经计算结果表明, 根据换算公式计算出每种采样器每次采样所测得的粘质沙雷氏菌气溶胶浓度值, 结果见表3。表2　六级安德森采样器捕获粒子粒径分布情况及中值直径结果安德森采样器6级次序粒径分布3　讨论实验结果证明, 不同型号空气微生物采样器采样所得到的空气微生物浓度值不一致, 即采样器的采样效率存在差异。现有的采样器在采样过程和本收集培养过程中都会导致部分微生物失活或捕获率低, 从而不能准确还原活性微生物的粒子数。撞击式采样器(安德森)比其它类型采样器所采集的粒子数通常要多, 这是由于撞击式采样器上的小孔到琼脂平皿的间距短(仅几毫米), 采样压力低, 因此采样捕获率高且菌落失活率低。本实验发生的黏质沙雷菌气溶胶粒子中值直径为1.60 μm, 粒子落于六级安德森采样器的第5 级(捕获粒子直径1.1～ 2.2 μm)之前需要流经前四层内壁, 比简化成2级采样板的二级安德森采样器流动过程复杂, 壁损耗量大, 因此二级安德森采样器捕获率更高, 所采粒子数较多MerckMAS-100的单级采样板设计径分布范围窄, 较多粒子未能被捕获。AGI-30为全玻璃冲击式采样器, 采样入口的气流剪力会导致部分生物粒子失活, 捕获的生物粒子储存在液体中,需要进行过滤处理后贴膜培养, 增加了样品损耗的可能。过滤式采样器通过滤膜过滤来捕获气溶胶颗粒, 采样阻力在所有采样器中最大, 而且干燥气流流动会使捕获的生物粒子在滤膜上丧失生物活性。AGI-30需要将样品菌液过滤浓缩后再贴膜培养,过滤式采样器也必须等采样毕将滤膜从支撑装置中取出再贴膜培养, 二者均需要对样品进行二次处理, 因此较其它采样器在琼脂培养基上直接捕获粒子的实验误差要大。据研究证明, LWC-1 离心式采样器对<4 μm小粒径粒子的捕获效率非常低, 这于本实验所得结果一致〔7〕。试验结果证明, 用TK型气溶胶发生器发生的粘质沙雷菌气溶胶粒径分布范围稳定, 大多数气溶胶粒子位于六级安德森采样器的第四、五级和第六级采样皿, 粒谱集中在3.3 ～ 0.65 μm, 中值直径为中国消毒学杂志 2009年第 26卷第 3期 · 247·1.60 ±0.08 μm。相对于自然环境下的生物气溶胶粒子宽粒径分布, 实验室发生气溶胶粒径范围较稳定可控。研究表明, 气溶胶粒子在人体呼吸器官的积分节与其粒子大小有关, 10 ～ 30 μm的粒子会沉积在支气管, 6 ～ 10 μm的易沉着于小支气管, 而1 ～ 5 μm的粒子可直接侵入肺泡。本实验所发生的气溶胶粒子能直接侵入肺泡, 可以模拟侵入肺泡的感染性生物颗粒分布, 具有较大的医学意义。依据本实验结果, 如果研究对象为对生物体害较大的可吸入小粒径生物气溶胶, 推荐使用两种安德森采样器。本实验所建的实验室气溶胶发生法可以有效控制指示菌粒径分布, 利用此方法成功比较了6种采样器对小粒子微生物气溶胶的采集效率, 为采样器采样效率的比较提供了一种较稳定评价方法, 也为系统地比较不同条件下的采样器采样效率提供了一定研究基础。